Program POMOST

Wielkoskalowa analiza zależnej od mikroRNA regulacji ekspresji czynników splicingowych i różnicowego składania pierwotnego transkryptu genów związanych z nowotworzeniem w raku nerki typu jasnokomórkowego (ccRCC).

Okres realizacji projektu: 1 marca 2013 r. – 30 czerwca 2015 r.
Budżet projektu: 326 000,00 PLN
Udział Unii Europejskiej: 277 100,00 PLN
Nr projektu: POMOST/2012-6/1
Kierownik projektu: Dr n. med. Joanna Bogusławska

Rak nerki typu jasnokomórkowego (ccRCC), jest najczęściej występującym rakiem nerki (85% przypadków), charakteryzującym się wysoką śmiertelnością i tworzeniem częstych przerzutów. Możliwości skutecznego leczenia tego nowotworu, zwłaszcza w jego zaawansowanej postaci są ograniczone, dlatego intensywnie poszukuje się markerów pozwalających na wczesne wykrywanie choroby.

Jednym z molekularnych zaburzeń obserwowanych w ccRCC są nieprawidłowości w różnicowym składaniu pierwotnego transkryptu (in. alternatywnego splicingu). Proces ten polega na wycinaniu z pierwotnego transkryptu (pre-mRNA) sekwencji niekodujących mRNA (intronów) i różnicowemu łączeniu sekwencji kodujących (eksonów). Dzięki temu na matrycy jednego genu możliwa jest synteza wielu różnych wariantów (izoform) mRNA, a w konsekwencji wielu różnych białek, często pełniących odmienne funkcje. Proces alternatywnego splicingu jest regulowany przez wyspecjalizowane białka, zwane czynnikami splicingowymi, wśród których można wyróżnić białka SR oraz białka z rodziny hnRNP. Czynniki te konkurują ze sobą o wiązanie z elementami regulatorowymi w pre-mRNA powodując włączanie eksonów (SR, w tym głównie SF2/ASF) bądź wyłączanie eksonów (hnRNP, np. hnRNPA1), zatem końcowy efekt różnicowego składnia pre-mRNA zależy od ich stężenia w komórce.

W ostatnich latach, w różnych typach nowotworów, wykazano zaburzenia w ekspresji czynników splicingowych, które prowadzą do powstawania nieprawidłowych wariantów transkrypcyjnych bądź zaburzania stosunków ilościowych pomiędzy prawidłowymi izoformami. Szczególne znaczenie mają zaburzenia splicingu prowadzące do zmian właściwości onkogenów, supresorów nowotworowych i regulatorów apoptozy.

Jednym z nowotworów, w których zaobserwowano zmienioną ilość czynników splicingowych, jest rak nerki typu jasnokomórkowego. Nie wiadomo jednak, co jest powodem, tych zaburzeń. Celem naszego projektu jest zbadanie, czy nieprawidłowa ekspresja czynników splicingowych w raku nerki spowodowana jest przez cząsteczki mikroRNA. Stanowią one klasę małych (ok. 20-22 nukleotydowych), niekodujących cząsteczek RNA, które wiążą się do rejonów 3’UTR (ang. 3’ UnTranslated Region) genów docelowych, powodując zahamowanie translacji bądź degradację mRNA. Ekspresja tych cząsteczek jest bardzo często zaburzona w nowotworach, również w ccRCC. mikroRNA regulują ekspresję wielu onkogenów i genów supresorowych, jednocześnie same mogą pełnić ich funkcje. Dzięki tej właściwości, cząsteczki te są obiektem licznych badań testujących je jako cząsteczki terapeutyczne wykorzystywane w leczeniu raka.

Do tej pory nie ma prac analizujących rolę cząsteczek mikroRNA w regulacji ekspresji czyników splicingowych w raku nerki typu jasnokomórkowego. W związku z tym celem projektu jest identyfikacja mikroRNA regulujących ekspresję ośmiu czynników splicingowych: SF2/ASF (SFRS1), SC35 (SFRS2), SRp20 (SFRS3), SRp75 (SFRS4), SRp40 (SFRS5), SRp55 (SFRS6), 9G8 (SFRS7) i hnRNP A1. Zamierzamy również zbadać, czy ekspresja tych mikroRNA jest zaburzona w raku nerki typu jasnokomórkowego i czy zaburzenia te mogą wpływać na proces alternatywnego splicingów onkogenów i supresorów nowotworowych.

Szczegółowe cele projektu obejmują:

Wytypowanie cząsteczek mikroRNA potencjalnie regulujących ekspresję czynników splicingowych: SF2/ASF (SFRS1), SC35 (SFRS2), SRp20 (SFRS3), SRp75 (SFRS4), SRp40 (SFRS5), SRp55 (SFRS6), 9G8 (SFRS7) i hnRNP A1; analizę poziomu ich ekspresji w próbkach ccRCC i odpowiadających im próbkach kontrolnych, a następnie analizę korelacji ekspresji wytypowanych cząsteczek miRNA z poziomem ekspresji badanych czynników splicingowych.
Weryfikację oddziaływania wytypowanych cząsteczek miRNA z rejonami 3’UTR genów kodujących czynniki splicingowe, oraz zbadanie czy wytypowane cząsteczki mikroRNA wpływają na endogenny poziom analizowanych czynników splicingowych.
Analizę wpływu cząsteczek mikroRNA na splicing onkogenów i genów supresorowych, których splicing jest regulowany przez badane czynniki splicingowe (wybranych na podstawie dostępnej literatury).

W wyniku przeprowadzonych badań możemy otrzymać potencjalne narzędzie do regulacji poziomu syntezy kluczowych czynników splicingowych. Mamy nadzieję, że wykorzystując zidentyfikowane w projekcie cząsteczki mikroRNA, można będzie w przyszłości zmieniać ilość czynników splicingowych w komórkach nowotworowych, a w ten sposób hamować proces nowotworzenia.